Gen Klonlama Nasıl Yapılır? Rekombinant DNA ve Plazmitler

Gen klonlamada hedef neden doğrudan bakteriye verilmez?

Klonlanmak istenen gen, tek başına konak hücreye verildiğinde hücre içinde kararlı biçimde korunmayabilir veya çoğaltılamayabilir. Bu nedenle gen, kendisini taşıyabilecek ve konak hücre içinde çoğalabilecek bir DNA molekülüne, yani vektöre yerleştirilir. Uygun replikasyon başlangıç bölgesine sahip ve seçilen konakla uyumlu plazmitler, kromozomal DNA'dan bağımsız olarak çoğalabilir.

Bir vektörün iki işlevini birbirinden ayırmak gerekir. İlk işlev, hedef DNA parçasını taşımak ve çoğaltılmasına aracılık etmektir. İkinci işlev ise plazmiti almış hücrelerin belirlenmesini sağlamaktır. Bu nedenle plazmitlerde çoğu zaman antibiyotik direnci gibi seçici işaretleyici genler bulunur. Antibiyotik içeren besiyerinde yalnızca ilgili direnç genini taşıyan hücreler çoğalabildiğinden, plazmit almamış hücreler popülasyondan ayıklanır.

Buradaki seçim, hedef genin kesin olarak bulunduğunu tek başına kanıtlamaz. Antibiyotik direnci, çoğunlukla hücrenin plazmit taşıdığını gösterir; hedef genin plazmite doğru biçimde yerleşip yerleşmediğini anlamak için ek bir doğrulama gerekir. Bu nedenle seçim aşaması, 'plazmit taşıyan hücreleri bulma' basamağıdır; 'doğru rekombinant klonu kesinleştirme' basamağıyla aynı değildir.

Restriksiyon enzimi ile kesim, uyumlu uçların oluşmasını nasıl sağlar?

Restriksiyon endonükleazları DNA üzerindeki belirli nükleotit dizilerini tanır ve DNA'yı bu bölgelerden keser. Hedef geni içeren DNA ile vektör aynı restriksiyon enzimiyle kesildiğinde, iki DNA parçasında birbirini tamamlayabilen uçlar oluşabilir. Bu uçlar tek sarmallı çıkıntılar içeriyorsa yapışkan uç olarak adlandırılır.

Yapışkan uçların avantajı, hedef DNA ile vektörün birbirine uygun biçimde yaklaşmasını sağlamasıdır. Ancak uçların geçici olarak eşleşmesi, DNA moleküllerinin kalıcı olarak birleştiği anlamına gelmez. Kalıcı birleşme için DNA ligaz gerekir. Ayrıca kesim bölgesinin hedef genin işlevsel bir bölümünü bozup bozmadığı ve genin vektöre hangi yönde yerleştiği de önem taşıyabilir. Bu ayrıntılar, yalnızca 'aynı enzimle kesildi' bilgisinin neden yeterli olmadığını gösterir.

Kesim sonucunda oluşabilecek uçlar yalnızca yapışkan uçlardan ibaret değildir. DNA'nın iki zincirinin aynı hizada kesilmesiyle küt uçlar da oluşabilir. Küt uçlarda tamamlayıcı çıkıntı bulunmadığından parçaların kendiliğinden hizalanma avantajı daha azdır; yine de ligaz aracılığıyla birleştirme mümkündür. Bu nedenle yapışkan uçlar bir kolaylık sağlar, fakat rekombinant DNA oluşumu için tek koşul değildir.

Ligasyon ve transformasyon: rekombinant plazmit hücreye nasıl ulaşır?

Kesilmiş hedef DNA ve plazmit uygun uçlar üzerinden bir araya getirildikten sonra DNA ligaz kullanılır. Ligaz, DNA omurgasındaki fosfodiester bağlarının oluşmasına yardım ederek parçaları kalıcı bir DNA molekülü hâline getirir. Farklı kaynaklardan gelen DNA parçalarının aynı molekülde birleşmesiyle rekombinant DNA oluşur.

Sonraki aşama transformasyondur. Bu terim, bakterinin dışarıdan verilen rekombinant plazmiti almasını ifade eder. Bakteri hücreleri DNA alımına elverişli hâle getirilebilir; mevcut metinde belirtilen yaklaşımlar arasında kalsiyum klorürle kimyasal işlem ve elektroporasyon, yani elektrik şoku bulunur. Bu yöntemlerin amacı, plazmit DNA'sının hücre içine girebilmesini kolaylaştırmaktır.

Transformasyondan sonra her bakteri hücresinin plazmit aldığı varsayılmaz. Bu yüzden seçici işaretleyici gen önem kazanır. Plazmitteki antibiyotik direnci, hücrenin belirli antibiyotik içeren ortamda yaşamını sürdürmesine imkân verir. Fakat seçilebilir olmak ile hedef geni doğru taşımak farklı sorulardır. İlk soru 'Hücre plazmit aldı mı?', ikinci soru ise 'Alınan plazmit hedef geni içeriyor mu?' şeklindedir.

Antibiyotik seçimi ile mavi-beyaz ayrımı arasındaki fark

Seçici işaretleyici gen, plazmit taşıyan hücreleri plazmit taşımayanlardan ayırır. Örneğin antibiyotik direnci içeren bir plazmit kullanıldığında, antibiyotikli besiyerinde direnç genini taşımayan bakteriler çoğalamaz. Bu basamak, transformasyonun başarılı olup olmadığını değerlendirmek için kullanılır.

Bazı plazmitlerde antibiyotik direncine ek olarak lacZ geni de bulunabilir. Hedef DNA, lacZ geninin bulunduğu bölgeye yerleştirilirse bu genin işlevi bozulabilir. Böylece kolonilerin renk farkına dayanan mavi-beyaz ayrımından yararlanılarak, hedef DNA eklenmiş olma ihtimali bulunan koloniler önceliklendirilebilir. Ancak bu ayrım da tek başına bütün moleküler ayrıntıları kanıtlamaz; uygun koloni daha ileri incelemeyle doğrulanmalıdır.

Antibiyotik seçimi plazmit taşıyan hücreleri seçer; mavi-beyaz tarama ise uygun konak ve substrat koşullarında lacZ işlevinin bozulduğu kolonileri rekombinant klon adayı olarak ayırt eder. lacZ temelli bu renk ayrımı genellikle X-gal ve IPTG gibi bileşenlerin uygun koşullarda kullanılmasına bağlıdır; yalnızca plazmitte lacZ bölgesinin bulunması renk farkını kendiliğinden oluşturmaz. Sonuç mutlaka ek doğrulamayla sınanmalıdır. Sınav sorularında bir plazmidin iki farklı işaretleyici taşıması, 'seçim' ile 'rekombinant klonların ayrımı' arasındaki farkı ölçmek için kullanılabilir.

Genin çoğaltılması ile protein üretimi neden aynı sonuç değildir?

Bir genin plazmit içine yerleştirilmesi, öncelikle o DNA parçasının konak hücre içinde korunmasını ve çoğaltılmasını hedefleyebilir. Bu işlem sonunda hedef genin çok sayıda kopyası elde edilir; fakat genin okunarak proteine dönüştürülmesi için ayrıca uygun düzenleyici diziler ve konak sistem gerekir.

Protein üretimi amaçlandığında ekspresyon vektörleri kullanılır. Bu vektörlerde genin transkripsiyonunu ve ardından translasyonunu destekleyen güçlü promotörler ile başka düzenleyici diziler bulunabilir. Genin DNA'dan RNA'ya aktarılması transkripsiyon, RNA bilgisinden protein sentezlenmesi ise translasyondur. Bu nedenle klonlama, transkripsiyon ve translasyon birbirini tamamlayabilen ama aynı anlama gelmeyen süreçlerdir.

Konak sistemin seçimi de hedefe bağlıdır. Bakteri, maya, böcek hücresi veya memeli hücresi için özelleştirilmiş vektörler kullanılabilir. Özellikle karmaşık proteinlerde doğru katlanma ve post-translasyonel modifikasyon gereksinimleri, yalnızca genin kopya sayısına bakılarak çözülemez. Sonuç olarak 'çok sayıda DNA kopyası' ile 'çok miktarda işlevsel protein' arasında doğrudan ve koşulsuz bir eşitlik kurulamaz.

Çözümlü örnek: hedef geni taşıyan bakteriyel klonun seçilmesi

Verilenler: Bir araştırmacı, hedef geni bir bakteriyel plazmite yerleştirmek istiyor. Plazmitte antibiyotik direnci sağlayan bir seçici işaretleyici ve hedef genin yerleştirileceği lacZ bölgesi bulunuyor. Hedef DNA ile plazmit, uyumlu uçlar oluşturacak aynı restriksiyon enzimiyle kesiliyor.

Çözüm adımları:

1. Hedef DNA ve plazmit aynı restriksiyon enzimiyle kesilir. Böylece iki parçada birbirini tamamlayabilen uçların oluşması sağlanır.
2. Hedef DNA plazmite yaklaştırılır ve DNA ligaz kullanılarak fosfodiester bağları kurulur. Bu aşamada hedef geni içeren rekombinant plazmit oluşması amaçlanır.
3. Rekombinant plazmit bakteriye aktarılır. Ancak transformasyon verimi tam olmadığı için tüm bakterilerin plazmit aldığı kabul edilmez.
4. Bakteriler antibiyotik içeren besiyerine alınır. Antibiyotik direncini taşımayan bakteriler elenir; direnç genini taşıyan koloniler büyüyebilir.
5. Büyüyen koloniler arasında lacZ bölgesindeki değişikliğe göre mavi-beyaz tarama yapılır. Hedef genin lacZ bölgesine yerleştiği düşünülen koloniler, rekombinant klon adayı olarak ayırt edilir.
6. Sonuç, henüz yalnızca seçim ve ön taramadır. Antibiyotik direnci plazmit varlığını, renk ayrımı ise hedef genin uygun bölgeye yerleşmiş olma olasılığını destekler. Doğru klonu kesinleştirmek için ek doğrulama gerekir.

Sonuç: En uygun aday, antibiyotik ortamında büyüyen ve lacZ bölgesindeki yerleşime uygun renk özelliği gösteren kolonidir. Bu örnekte karar iki ayrı kanıta dayanır: hücrenin plazmit taşıması ve hedef DNA'nın plazmite yerleşmiş olma ihtimali.

Çözümlü örnek: klonlama mı, gen ifadesi mi?

Verilenler: Bir plazmitin içinde hedef gen bulunmaktadır. Bakteriler antibiyotikli ortamda çoğalmış ve hedef genin DNA kopyaları elde edilmiştir. Araştırmacı aynı zamanda bu genin protein ürününü üretmek istemektedir.

Çözüm adımları:

1. Bakterilerin antibiyotikli ortamda çoğalması, plazmit üzerindeki seçici işaretleyicinin işlev gördüğünü düşündürür. Bu bilgi, hücrelerin plazmit taşımasıyla ilgilidir.
2. Plazmitte hedef genin bulunması, genin DNA düzeyinde klonlanmış olduğunu gösterir. Bu, hedef genin kopyalarının çoğaltılmasıdır.
3. Protein üretimi için hedef genin transkripsiyona ve translasyona uygun biçimde düzenlenmesi gerekir. Sıradan bir klonlama vektöründe bu düzenleyici öğelerin bulunması garanti edilmez.
4. Araştırmacı protein üretimini amaçlıyorsa, genin ilgili konak sistemde çalışmasına uygun promotör ve diğer düzenleyici dizileri taşıyan bir ekspresyon vektörü seçmelidir.
5. Konak sistem de değerlendirilmelidir. Protein doğru katlanma veya post-translasyonel değişiklik gerektiriyorsa yalnızca bakteri hücresinde DNA kopyalarının artması yeterli olmayabilir.

Sonuç: Hedef genin plazmitte bulunması klonlamanın başarılı olabileceğini gösterir; protein üretiminin gerçekleştiğini kanıtlamaz. Bu iki sonucu birbirinden ayırmak, gen klonlama sorularındaki temel karar noktasıdır.

Sık yapılan hatalar ve karıştırılan kavramlar

• Gen klonlamayı canlı klonlamasıyla eşitlemek: Gen klonlamada çoğaltılan şey çoğunlukla belirli bir DNA parçasıdır. Bir canlının bütününün kopyalanması farklı bir biyolojik süreçtir.

• Restriksiyon enzimi ile ligazın görevlerini karıştırmak: Restriksiyon enzimi belirli dizilerden kesim yapar; DNA ligaz kesilmiş parçaları bağlar. Biri kesme, diğeri birleştirme basamağında görev alır.

• Transformasyonu DNA replikasyonuyla aynı sanmak: Transformasyon, plazmitin bakteriye alınmasıdır. Hücre plazmiti aldıktan sonra plazmitin çoğaltılması DNA replikasyonu süreçleriyle ilişkilidir.

• Antibiyotik direncini hedef genin kanıtı saymak: Direnç, çoğunlukla plazmitin hücrede bulunduğunu gösterir. Hedef genin vektöre doğru yerleşip yerleşmediği doğrulanmalıdır; yönelimin doğrulanması ise klonlama amacına, vektör tasarımına ve özellikle gen ifadesi gereksinimine bağlıdır.

• Her klonlanan genin protein üreteceğini düşünmek: DNA'nın çoğaltılması ile gen ifadesi farklıdır. Protein üretimi için uygun promotör, düzenleyici diziler ve konak sistem gerekir.

• 'Yapışkan uç varsa DNA kesin birleşir' demek: Yapışkan uçlar uygun hizalanmayı kolaylaştırır; kalıcı bağların oluşması için ligaz gerekir. Ayrıca uçların uyumu, kesim bölgesi ve genin vektördeki yerleşimi değerlendirilmelidir.

• Seçim ile doğrulamayı tek basamak sanmak: Seçim, uygun adayları azaltır; doğrulama ise aday klonun hedef DNA'yı taşıdığını daha güvenilir biçimde ortaya koymayı amaçlar.