CRISPR-Cas9 Nasıl Çalışır? PAM, DNA Kesimi ve Onarım

CRISPR hafızası, Cas9 ve rehber RNA aynı şey değildir

Doğal CRISPR sisteminde bakterinin genomunda tekrarlayan diziler ve bu tekrarların arasında daha önce karşılaşılan bakteriyofajlardan alınmış ara parçalar, yani spacer'lar bulunur. Bu ara parçalar, geçmişteki viral dizilere ilişkin bir tür moleküler hafıza sağlar. Cas proteinleri bu sistemin çalışmasına katılan proteinlerdir; Cas9 bunlardan biri olup DNA kesimi yapabilen bir nükleazdır.

Gen düzenleme uygulamasında doğal CRISPR RNA'sı ile tracrRNA'nın işlevleri çoğu zaman tek bir sentetik rehber RNA'da birleştirilir. Bu RNA'nın iki yönlü görevi vardır: Bir bölümü hedef DNA ile baz eşleşmesi yaparak hedef seçimine katkıda bulunur, diğer bölümü Cas9 proteiniyle etkileşir. Dolayısıyla hedefi 'Cas9 tek başına bulur' demek doğru değildir; Cas9'un hedefe yönlendirilmesinde rehber RNA'nın dizi bilgisi önemlidir.

Hedefleme kararı yalnızca rehber RNA'nın tamamlayıcılığına da bağlı değildir. Cas9'un DNA'ya etkili biçimde bağlanıp kesim yapabilmesi için hedef bölgenin hemen yanında uygun bir PAM, yani Protospacer Adjacent Motif bulunmalıdır. Verilen metinde Cas9 için örnek PAM dizisi NGG olarak belirtilir. Buradaki N herhangi bir nükleotidi, G ise guanini ifade eder. PAM, hedeflenen eşleşme bölgesinin yanında aranır ve Cas9'un hedefi değerlendirmesinde gereklidir; PAM'ın kendisi kesilen hedef bölüm olarak düşünülmez.

Bu ayrım sınav açısından önemlidir: CRISPR dizileri doğal savunma sisteminin genomik temelini, rehber RNA hedefleme aracını, Cas9 ise kesimi gerçekleştiren proteini ifade eder.

Hedef DNA'dan çift zincir kırığına: Cas9'un karar sırası

CRISPR-Cas9 aracılı klasik bir düzenleme birkaç ardışık kontrol içerir. İlk olarak rehber RNA, hedef DNA'da kendisine tamamlayıcı bir dizi arar. Tamamlayıcılık, RNA-DNA baz eşleşmesine dayanır; fakat yalnızca benzer bir dizinin bulunması yeterli kabul edilmez. Yakında uygun PAM bulunması gerekir. Bu nedenle bir DNA bölgesinin rehber RNA ile eşleşmesi, tek başına Cas9 kesimi için yeterli değildir.

PAM uygunluğu sağlandığında rehber RNA ile DNA arasında eşleşme oluşur ve Cas9 hedef DNA'nın iki zincirinde kırık meydana getirir. Bu olay, çift zincir kırılması veya DSB olarak adlandırılır. DSB bir sonuç değil, gen düzenleme sürecinin başlangıç noktasıdır. Hücre bu kırığı onarmaya çalışır ve düzenlemenin biçimi büyük ölçüde bu onarımın sonucuna göre belirlenir.

Hedef dışı, yani off-target kesim riski burada ortaya çıkar. Hedef diziye benzeyen fakat aynı olmayan başka DNA bölgeleri de uygun koşullarda istenmeyen biçimde etkilenebilir. Bu nedenle rehber RNA tasarımı ve yüksek özgüllüklü Cas9 varyantları, hedef dışı değişiklikleri azaltmaya yönelik yaklaşımlar olarak kullanılır. Ancak bu ifadeler riski ortadan kaldırıldığı anlamına gelmez; amaç riski azaltmak ve düzenlemeyi değerlendirmektir.

Bir hedef bölgenin seçimini şu kontrol listesiyle özetleyebiliriz:

1. İstenen gen veya DNA bölgesi belirlenir.
2. Bu bölgeyle tamamlayıcı olabilecek rehber RNA dizisi düşünülür.
3. Hedef dizinin yanında uygun PAM bulunup bulunmadığı kontrol edilir.
4. Benzer başka DNA bölgelerinde istenmeyen eşleşme ve kesim olasılığı değerlendirilir.
5. Kesimden sonra hangi onarım yolunun istenen sonucu vereceği planlanır.

NHEJ ve HDR: aynı kırık, farklı genetik sonuç

Cas9'un oluşturduğu çift zincir kırığından sonra hücre, DNA bütünlüğünü yeniden sağlamaya çalışır. Mevcut metinde öne çıkan iki yol NHEJ ve HDR'dir. Bu yolların farkı, onarımın nasıl yapıldığı ve bunun genin işlevine ne yaptığıdır.

NHEJ, kırılan DNA uçlarının doğrudan birleştirilmesine dayanır. Bu yol hızlı olabilir; fakat birleştirme sırasında küçük eklemeler veya silmeler, yani indeller oluşabilir. İndel, bir genin kodlayan bölgesinde okuma çerçevesini bozarsa veya işlevsel bir bölgeyi etkilerse genin işlevi azalabilir ya da kaybolabilir. NHEJ kaynaklı indeller, uygun bir kodlayan bölgeyi bozduğunda genin işlev kaybına veya knockout'a yol açabilir. Gen susturma terimi ise gen ifadesinin azaltılması için ayrı kullanılmalıdır. Ancak NHEJ'nin 'her durumda geni susturacağı' söylenemez; sonuç, oluşan değişikliğin konumuna ve büyüklüğüne bağlıdır.

HDR ise kırığın onarımı sırasında homolog bir DNA kalıbından yararlanır. Araştırmacılar, istenen değişikliği taşıyan bir donor DNA sağlarsa hücre bu kalıbı kullanarak daha hedefli bir ekleme veya düzeltme yapabilir. Nokta mutasyonunun düzeltilmesi ya da belirli bir genetik dizinin eklenmesi HDR ile ilişkilendirilir. HDR'nin kullanılabilmesi için uygun bir kalıp ve hücrenin bu onarım yolunu gerçekleştirebilmesi gerekir. Bu nedenle HDR, NHEJ'ye göre her hücre tipinde ve her koşulda aynı verimle gerçekleşen bir süreç olarak sunulmamalıdır.

Karar kuralı şöyledir: Amaç çoğunlukla gen işlevini bozmaksa ve küçük indeller yeterliyse NHEJ sonucu değerlendirilebilir. Amaç belirli bir diziyi hassas biçimde eklemek veya düzeltmekse, uygun donor DNA içeren HDR planlanır. Sonucun gerçekten gerçekleşip gerçekleşmediği ise yalnızca Cas9'un kesmiş olmasına bakılarak değil, onarım sonrası DNA dizisi incelenerek belirlenir.

Bu nokta DNA yapısı, DNA replikasyonu ve mutasyonlar konularıyla doğrudan bağlantılıdır. CRISPR yeni bir DNA onarım sistemi oluşturmaz; hücrenin var olan onarım mekanizmalarını, belirli bir bölgede kırık oluşturarak genetik değişiklik elde etmek amacıyla yönlendirmeye çalışır.

Çözümlü örnek: Bir geni NHEJ ile işlevsizleştirme veya knockout oluşturma mantığı

Verilenler: Bir araştırmacı, işlevi incelenmek istenen bir genin kodlayan bölgesinde Cas9 ile çift zincir kırığı oluşturmak istiyor. Seçilen rehber RNA hedef bölgeyle tamamlayıcı ve hedefin yanında uygun bir PAM bulunduğu varsayılıyor. Amaç, yeni bir gen eklemek değil; gen işlevini kaybeden hücreleri elde etmek.

Çözüm adımları:

1. Hedef doğrulanır. Rehber RNA'nın hedef DNA ile tamamlayıcı olması, Cas9'un doğru bölgeye yönlendirilmesine yardım eder. Yakındaki PAM'ın uygun olması da Cas9 kesimi için gerekli koşullardan biridir.
2. Cas9 kesimi gerçekleşir. Cas9 hedef DNA'nın iki zincirinde DSB oluşturur. Bu aşamada gen henüz susturulmuş sayılmaz; yalnızca onarım gerektiren bir kırık meydana gelmiştir.
3. NHEJ sonucu beklenir. Hücre kırık uçlarını birleştirirken küçük bir ekleme veya silme oluşturabilir. Örneğin kodlayan dizide üç bazdan farklı sayıda nükleotit silinmesi, üçlü okuma düzenini değiştirebilir. Böyle bir çerçeve kayması, proteinin doğru biçimde üretilmesini engelleyebilir.
4. Sonuç doğrulanır. Hücrelerin gen işlevini kaybettiği yalnızca 'Cas9 kullanıldı' bilgisiyle çıkarılamaz. Onarım sonrası DNA dizisi ve gerekiyorsa gen ürünü incelenmelidir.

Sonuç: Uygun hedef ve PAM koşullarında Cas9 kesimi, NHEJ aracılığıyla indel oluşturabilir; indel genin işlevsel bölgesini bozuyorsa knockout elde edilebilir. Fakat indelin konumu ve dizisi sonucu belirlediği için NHEJ, otomatik olarak aynı genetik sonucu üretmez.

Çözümlü örnek: HDR ile nokta değişikliği planlama

Verilenler: Bir DNA dizisindeki belirli bir nokta mutasyonunun düzeltilmesi amaçlanıyor. Hedef bölgeye uygun rehber RNA ve PAM bulunduğu, ayrıca düzeltilmiş diziyi taşıyan donor DNA'nın hücreye sağlandığı kabul ediliyor. Amaç genin rastgele bozulması değil, belirli bir dizinin değiştirilmesi.

Çözüm adımları:

1. Hedef mutasyon tanımlanır. Değiştirilmesi gereken nükleotit ve çevresindeki DNA bölgesi belirlenir. Bu, 'geni susturma' hedefinden farklıdır; burada belirli bir dizinin doğru biçimde değiştirilmesi istenir.
2. Rehber RNA ve PAM kontrol edilir. Rehber RNA hedef bölgeye yönelmeli, hedefin yanında Cas9 için uygun PAM bulunmalıdır. Bu koşullardan biri yoksa klasik Cas9 kesimi planlandığı biçimde gerçekleşmeyebilir.
3. Donor DNA hazırlanır. Donor DNA, istenen düzeltilmiş diziyi taşıyan bir kalıp görevi görür. HDR'nin hedefe yönelik değişiklik oluşturabilmesi bu kalıbın kullanılmasına bağlıdır.
4. DSB sonrası onarım izlenir. Cas9 kırığı oluşturduktan sonra hücre HDR yolunu kullanırsa donor DNA'daki bilgi onarıma aktarılabilir. Böylece amaçlanan nokta değişikliği genomda yer alabilir.
5. Düzenleme doğrulanır. Hedef dizinin gerçekten düzeldiği ve istenmeyen değişikliklerin oluşmadığı ayrıca değerlendirilmelidir.

Sonuç: HDR, belirli bir mutasyonu düzeltme veya hedefli bir dizi ekleme fikrine uygundur; ancak yalnızca kesim yapılması HDR sonucunu garanti etmez. Donor DNA'nın bulunması, hücrenin HDR'yi kullanması ve ortaya çıkan dizinin doğrulanması gerekir.

CRISPR uygulamalarında hedef ile yöntemi eşleştirme

Temel biyolojik araştırmalarda CRISPR, bir genin işlevini incelemek için kullanılabilir. Gen NHEJ sonucunda işlevini kaybederse araştırmacı, bu genin hücre büyümesi, gelişimi veya hastalık sürecindeki rolünü karşılaştırmalı olarak inceleyebilir. Burada CRISPR'ın sağladığı şey doğrudan 'hastalığı açıklamak' değil, belirli bir genetik değişiklik ile gözlenen biyolojik sonuç arasındaki ilişkiyi araştırma olanağıdır.

Genetik hastalıklar bağlamında iki farklı yaklaşım ayrılmalıdır. Hastalığa yol açan genin işlevini azaltmak isteniyorsa knockout yaklaşımı düşünülebilir; bozuk bir dizinin düzeltilmesi veya yeni bir dizinin eklenmesi hedefleniyorsa HDR gibi hedefli onarım yolları gündeme gelir. Bu olasılıklar araştırma ve tedavi geliştirme potansiyelini açıklar, fakat her hastalık için uygulanabilir veya klinik olarak güvenli bir tedavi anlamına gelmez.

Tarım ve biyoteknolojide hastalığa direnç, verim veya besin özelliği gibi nitelikleri değiştirmeye yönelik çalışmalar yapılabilir. Viral enfeksiyonlarda virüsün genetik materyalini hedefleme, kanserde ise T hücrelerinin kanser hücrelerini tanıma ve yok etme kapasitesini değiştirme araştırılmaktadır. Bu örneklerde ortak mantık, hedef DNA veya hücresel gen işlevinin değiştirilmesidir; kullanılan hücre tipi, teslimat yöntemi ve güvenlik değerlendirmesi ise uygulamaya göre değişir.

Cas9 dışındaki Cas proteinleri farklı hedefleme ve kesim özellikleri sağlayabilir. Cas12a farklı PAM gereksinimleri sunabilir; Cas13 ise RNA hedeflemeye yönelik bir araç olarak anılır. Baz düzenleyiciler, klasik çift zincir kırığı oluşturmadan belirli baz dönüşümlerini yapmayı amaçlar. Prime düzenleyiciler de daha çeşitli ekleme, silme veya nokta değişikliği hedefleri için geliştirilmiştir. Bu araçlar klasik Cas9-NHEJ/HDR şemasının aynısı değildir; bu nedenle bütün CRISPR uygulamalarını 'Cas9 keser, NHEJ onarır' biçiminde genellemek doğru olmaz.

Sık yapılan hatalar ve karıştırılan sınır durumları

1. 'CRISPR DNA'nın kendisidir' demek: CRISPR, doğal sistemdeki tekrarlı diziler ve aralardaki spacer'larla ilişkilidir. Gen düzenleme aracında ise rehber RNA, Cas proteini ve hedef DNA birlikte değerlendirilir.

2. PAM'ı kesilen DNA parçası sanmak: PAM, Cas9'un hedefi tanıması ve kesim yapabilmesi için gerekli komşu motif olarak anlatılır; hedef DNA eşleşme bölgesinden ayrı düşünülmelidir.

3. Cas9 kesince genin otomatik sustuğunu düşünmek: Kesim yalnızca DSB oluşturur. Gen susturulması, çoğunlukla NHEJ'nin oluşturduğu indelin gen işlevini bozmasına bağlıdır; her indel aynı etkiyi yapmaz.

4. NHEJ ile HDR'yi eş anlamlı kullanmak: NHEJ doğrudan uç birleştirmeye ve çoğu kez küçük indellere dayanır. HDR ise homolog donor DNA kalıbından yararlanarak hedefli değişiklik sağlayabilir.

5. HDR'nin her hücrede aynı verimde gerçekleştiğini varsaymak: HDR için uygun donor DNA ve hücrenin bu onarım yolunu kullanabilmesi gerekir. Bu nedenle HDR, koşullara bağlı bir onarım seçeneğidir.

6. Hedef dışı etkileri yok saymak: Hedefe benzeyen başka diziler istenmeyen biçimde etkilenebilir. Rehber RNA tasarımı ve yüksek özgüllüklü Cas9 varyantları bu riski azaltmayı amaçlar; sıfır risk iddiası kaynakta desteklenmemektedir.

7. Araştırma potansiyelini kesin tedavi gibi sunmak: Genetik hastalıklar, viral enfeksiyonlar ve kanser için CRISPR tabanlı yaklaşımlar araştırılmaktadır. 'Potansiyel' ifadesi, her uygulamanın tamamlanmış ve tüm hastalara uygulanabilir olduğu anlamına gelmez.

8. Somatik hücre ile germ hattını karıştırmak: Germ hattı düzenlemeleri üreme hücreleriyle ilişkilidir ve değişikliklerin gelecek nesillere aktarılması etik tartışmaları artırır. Bu durum, tek bir hastanın hücrelerinde yapılan düzenlemeden farklı sonuçlar doğurur.